Delezione della regione altamente ristretta critica per la sindrome di Down in cellule umane con trisomia 21 mediante il sistema CRISPR-Cas9
Settore in cui opera l'ente
Ricerca scientifica e tecnologica
Ricerca scientifica e tecnologica
Città in cui opera l'ente
Bologna
Imola
Bologna
Imola
Tipologia ente
Università pubblica
Sito Web
https://www.unibo.it/it
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IL PROGETTO
Il progetto finanziato dalla Fondazione Carisbo è stato eseguito presso il Dipartimento di Medicina Specialistica Diagnostica e Sperimentale (DIMES) dell’Università di Bologna. Questo finanziamento ha permesso l’acquisto di una strumentazione di laboratorio molto sofisticata “Countess 3 FL Automated CellCounter”, ovvero di un conta cellule automatico in grado rilevare il numero di cellule vive e morte di un campione biologico, ed il numero di cellule fluorescenti in un campione di cellule trattate con sistemi di editing genomico marcati con molecole fluorescenti. Nell’ambito del progetto sono state svolte tre attività principali:
1) allestimento di colture cellulari di fibroblasti con trisomia 21 ed euploidi;
2) messa a punto di un metodo di editing genomico (CRISPR-Cas9) efficace per la delezione di due regioni del cromosoma 21 umano, la regione altamente ristretta critica per la sindrome di Down (HR-DSCR) e la sequenza del gene DYRK1A codificante per il dominio catalitico dell’enzima;
3) dosaggio di 5 metaboliti prodotti durante il ciclo metabolico dei mono-carboni, in particolare tetraidrofolato (THF), 5-metil-THF, 5-formil-THF, S-adenosil-metionina ed S-adenosil-omocisteina, mediante saggi immunoenzimatici (ELISA). Questi metaboliti sono stati dosati sia nelle cellule con trisomia 21 che in quelle euploidi di controllo.
Immagine acquisita al “Countess 3 FL Automated CellCounter” di cellule con trisomia 21 dopo il distacco dal supporto su cui crescono. Dentro i cerchietti verdi vi sono le cellule vive (live), dentro i cerchietti rossi le cellule morte (dead).
Il finanziamento della Fondazione Carisbo ha contribuito all’acquisto di una strumentazione di laboratorio molto sofisticata, in particolare del “Countess 3 FL Automated CellCounter”. Questo strumento è un conta cellule automatico che ci ha permesso di ottimizzare i tempi della ricerca e ricavare delle misure più precise del numero delle cellule che vengono utilizzate negli esperimenti di editing genomico che rientrano nel progetto.
- Maria Caracausi
L'IMPATTO DEL PROGETTO
Il progetto finanziato dalla Fondazione Carisbo è stato eseguito presso il Dipartimento di Medicina Specialistica Diagnostica e Sperimentale (DIMES) dell’Università di Bologna. Nell’ambito del progetto sono stati eseguiti esperimenti di editing genomico mediante il sistema CRISPR-Cas9 in 3 linee di fibroblasti umani con trisomia 21, in particolare è stata eseguita la delezione della regione del cromosoma 21 altamente ristretta, critica per la sindrome di Down (HR-DSCR) e di un gene noto (DYRK1A) che ha funzionato da controllo positivo di delezione. Per ciascuna linea cellulare abbiamo messo a punto 4 condizioni: cellule non trattate (bianco), cellule elettroporate (controllo negativo), cellule elettroporate con CRISPR-Cas9 per la delezione della HR-DSCR e cellule elettroporate con CRISPR-Cas9 per la delezione di DYRK1A (controllo positivo). Per ciascuna condizione è stata eseguita l’estrazione del DNA. Il DNA estratto è stato usato per eseguire una PCR (polymerase chain reaction), per verificare se la delezione fosse avvenuta, ed una digital droplet PCR, per effettuare una quantificazione della percentuale di delezione sul DNA totale.
In un primo momento abbiamo osservato una scarsissima efficienza di delezione della HR-DSCR ed una elevata efficienza di delezione di DYRK1A. Abbiamo quindi provveduto a riprogettare il sistema di delezione sfruttando una regione genomica adiacente alla HR-DSCR che appare più accessibile al sistema di editing perché non contenente sequenze ripetute o potenzialmente metilate (analisi eseguita su Ensembl genome browser, https://www.ensembl.org/index.html).
L’ottimizzazione del sistema di editing della HR-DSCR ha mostrato una buona efficienza di delezione, difatti i risultati hanno mostrato che il numero di copie della HR-DSCR si è ridotto da 3 a 2,5, mentre il numero delle copie di DYRK1A da 3 a 2,2. Questi dati sono molto vicini a quelli attesi ovvero, una riduzione del numero di copie della HR-DSCR e di DYRK1A da 3 a 2 in tutte le cellule sottoposte ad editing.
Inoltre, tramite saggi immunoenzimatici (ELISA), abbiamo valutato la concentrazione di 5 metaboliti del ciclo dei mono-carboni (tetraidrofolato (THF), 5-metil-THF, 5-formil-THF, S-adenosil-metionina, S-adenosil-omocisteina), in lisati cellulari provenienti da fibroblasti trisomici (senza delezione) a confronto con fibroblasti di controllo euploidi.
I risultati ottenuti sono coerenti con quelli pubblicati in letteratura sui livelli degli stessi metaboliti nel plasma dei soggetti con sindrome di Down rispetto a soggetti di controllo euploidi (Vione et al., Frontiers in Medicine, 2022). In entrambi i campioni biologici viene riportato un eccesso di S-adenosil-omocisteina nella trisomia 21, un metabolita che in alta concentrazione è considerato citotossico. Sarà necessario confermare i dosaggi metabolici su un più alto numero di linee cellulari e ripetere i dosaggi anche in linee cellulari con delezione della HR-DSCR con il fine di valutare se, riducendo il numero di copie di questa regione, si verifichi un ripristino dei livelli dei metaboliti paragonabile a quello delle cellule euploidi.
Le attività svolte nel progetto saranno traslate anche su cellule staminali pluripotenti indotte (iPSc) derivanti da persone con trisomia 21 al fine di poter approfondire l’effetto della delezione della HR-DSCR sui meccanismi biologici delle cellule e poter identificare la relazione tra la HR-DSCR in tre copie e gli aspetti fenotipici della sindrome di Down. Questo permetterà di fare luce sui meccanismi biologici alterati nella sindrome di Down al fine di identificare dei possibili bersagli terapeutici per la cura di alcuni tratti patologici della sindrome.